Expresión de la proteína B8Y674 Candidatus Liberibacter asiaticus mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (page) y dot blot

Expressão da proteína B8Y674 Candidatus Liberibacter asiaticus por eletroforese em gel de poliacrilamida (page) e dot blot

Resumo

El Huanglongbing (HLB), es una de las enfermedades más devastadoras de los cítricos a nivel mundial y representa una seria amenaza para la citricultura mexicana. El agente causal es una bacteria incultivable que pertenece al género Candidatus Liberibacter spp. y afecta a todas las especies de cítricos, especialmente los cítricos agrios. Para su detección, se emplean técnicas moleculares como es la reacción en cadena de la polimerasa (QT-PCR), técnicas serológicas y espectrofotométricas. El objetivo de este trabajo fue expresar la proteína recombinante BY8743 de Candidatus Liberibacter mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12 % (PAGE) y Dot Blot. Para obtener la secuencia se acudió a la base de datos del National Center Biotechnology Information (NCBI). Una vez obtenida la secuencia, se revisó y modificó el marco de lectura abierto, por sus siglas en ingles Open Reading Frame (ORF) mediante el programa CLC Main Workbench 7 y se procedió a sintetizar el vector pET22b+, también se verificó el codón de inicio y de termino acoplado al vector. Para la transformación se usaron células comerciales One Shot® TOP10 Chemically Competent (Invitrogen^TM), posteriormente fueron subclonadas en células de E. coli BL21. Se realizaron minipreparaciones usando un método de lisis alcalina y además se realizó una cinética de crecimiento, observando que en tres horas se alcanza la fase estacionaria. Se aplicaron concentraciones de 0.5, 0.8 y 1 mM del inductor metabólico isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y la mejor concentración fue 1 mM, ya que a las cuatro horas después de su aplicación se pudo visualizar una proteína sobreexpresada de 38 kDa. Cuando se realizó el Dot Blot se obtuvieron resultados sobresalientes de inmunoexpresión en las tres concentraciones del inductor utilizado a diferencia del control y de las células sin transfectar.